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試管苗玻璃化（Vitrification）是植物組織培養(yǎng)過程中所特有的一種生理失調(diào)或生理病變。由P.Debergh（1981）首先命名。

       玻璃化試管苗因其體內(nèi)含水量高，干物質(zhì)、葉綠素、蛋白質(zhì)、纖維素和木質(zhì)素含量低、角質(zhì)層、柵欄組織等發(fā)育不全，表現(xiàn)為光合能力和酶活性降低，組織畸形，器官功能不全，分化能力降低，因此試管苗一旦出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象就很難繼續(xù)用作繼代培養(yǎng)和擴(kuò)大繁殖的材料。大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明試管玻璃化苗往往是在芽分化啟動(dòng)后的生長(zhǎng)過程中，由碳水化合物、氮代謝和水分狀態(tài)等發(fā)生生理異常所引起，它由多種因素影響和控制。

玻璃化試管苗的主要特征

• 試管苗葉、嫩梢呈水晶透明或半透明，水浸狀。

• 整株矮小腫脹、失綠。

• 葉片皺縮成縱向卷曲、脆弱易碎。

• 葉表缺少角質(zhì)層蠟質(zhì)，沒有功能性氣孔，不具有柵欄組織，僅有海綿組織。

一、玻璃苗發(fā)生的因素

（一）激素濃度

激索的影響包括生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素，一方面指細(xì)胞分裂素的濃度，另一方面是以上兩種激素的比例平衡。高濃度的細(xì)胞分裂素有利于促進(jìn)芽的分化，也會(huì)使玻璃化的發(fā)生比例提高，每種作物發(fā)生玻璃化的激素水平都不相同，有的品種在BA 0.5mg／L時(shí)就有玻璃化發(fā)生，如香石竹的部分品種；另一些種類在培養(yǎng)的特定階段可以忍受較高的濃度，而在其他階段的培養(yǎng)中，卻只需要較低的濃度，如非洲菊只有在BA達(dá)5～10mg／L時(shí)才可能誘導(dǎo)花芽脫分化出不定芽。在不定芽增殖時(shí)，BA的使用濃度只能在1mg／L左右；細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的比例失凋，細(xì)胞分裂素的含量顯著高于兩者之間的適宜比例，使組培苗正常生長(zhǎng)所需的激素水平失衡，也會(huì)導(dǎo)致玻璃化的發(fā)生。

許多學(xué)者證明培養(yǎng)基中BA濃度和培養(yǎng)溫度與玻璃化成正相關(guān)，BA濃度越高或培養(yǎng)溫度越高，玻璃苗比率越大。Debergh曾用14C-KT研究表明，隨瓊脂濃度的增加，KT利用率降低。同時(shí)也證明，隨BA濃度的增加，玻璃化率增加。Bornman等用14C-BA研究表明，14C-BA的積累與不定芽分化和玻璃化是同步的。玻璃化苗的一個(gè)重要特征是葉脈明顯加長(zhǎng)，而GA3也有類似效應(yīng)，也許GA3促進(jìn)了細(xì)胞過度生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致玻璃化。生長(zhǎng)素可以改變細(xì)胞壁的機(jī)械特性，使其具有更大的可塑性。

（二）培養(yǎng)基

       瓊脂和蔗糖濃度與玻璃化成負(fù)相關(guān)，瓊脂或蔗糖濃度越高，玻璃苗的比率越低。Daniel G. W. Brown認(rèn)為玻璃化可能是培養(yǎng)基滲透勢(shì)不當(dāng)所致。碳源不僅為芽的形成提供能量，而且也起滲透調(diào)節(jié)作用，主要影響培養(yǎng)基的滲透勢(shì)（Salisbury等）。隨瓊脂濃度及純度的增加，培養(yǎng)基硬度增加，從而影響其襯質(zhì)勢(shì)和水分狀況。雖瓊脂濃度的增加，玻璃化的比例明顯減少，但過多時(shí)培養(yǎng)基太硬，影響?zhàn)B分的吸收，使苗的生長(zhǎng)速度減慢。Debergh等研究表明，液體培養(yǎng)基的水勢(shì)影響玻璃苗的形成，Ziv等認(rèn)為只要降低培養(yǎng)容器中的相對(duì)濕度，就可以降低玻璃苗的比例。劉思穎等（1988）測(cè)得絲石竹玻璃苗葉片的水勢(shì)約為正常苗的1.9倍，含水量為正常苗的2.09倍—2.21倍。自由水和高濕度可能與肉質(zhì)嫩梢的形成有關(guān)。Davis等研究表明，液體培養(yǎng)是導(dǎo)致玻璃化的主要原因�？梢詳喽�，試管苗玻璃化可能是培養(yǎng)基內(nèi)水分狀態(tài)不適應(yīng)的一種生理變態(tài)。另外，培養(yǎng)基中高的含N量，特別是高的氨態(tài)N，也是導(dǎo)致玻璃化的因素。

（三）培養(yǎng)條件

       溫度主要影響苗的生長(zhǎng)速度，溫度升高時(shí)，苗的生長(zhǎng)速度明顯加快，高溫達(dá)到一定限度后，會(huì)對(duì)正常的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)生不良影響，促進(jìn)玻璃化的產(chǎn)生；變溫培養(yǎng)時(shí)溫度變化幅度大，忽高忽低的溫度變化容易在瓶?jī)?nèi)壁形成小水滴，會(huì)增加瓶?jī)?nèi)濕度，降低容器的透光率，提高玻璃化發(fā)生率。

       濕度包括瓶?jī)?nèi)的空氣濕度和培養(yǎng)基的含水量。瓶?jī)?nèi)濕度與通氣條件密切相關(guān)，使用有透氣孔的膜或通氣較好的濾紙、牛皮紙封口時(shí)，通過氣體交換瓶?jī)?nèi)濕度降低，玻璃化發(fā)生率減少。相反，如果用瓶蓋、不透氣的封口膜、錫薄紙封口時(shí)，不利于氣體的交換，瓶子內(nèi)處于不透氣的高濕條件下，苗的生長(zhǎng)勢(shì)快，但玻璃化的發(fā)生頻率也相對(duì)較高。一般來說在單位容積內(nèi)，培養(yǎng)的材料越多，苗的長(zhǎng)勢(shì)越快，玻璃化出現(xiàn)的頻率就越高。

       光照強(qiáng)度可以促進(jìn)光合作用，提高碳水化合物的含量，使玻璃化的比例降低。光照不足再加上高溫，極易引起組培苗的過度生長(zhǎng)，加速玻璃化發(fā)生。多數(shù)作物在光照10-12h，強(qiáng)度1500-2000Lx時(shí)能夠正常的生長(zhǎng)和分化。光照強(qiáng)度較弱時(shí)，可通過延長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行補(bǔ)償。

（四）氣體條件

       許多研究表明，非受傷的物理和化學(xué)協(xié)迫可以增加乙烯的合成。玻璃化被認(rèn)為是一種非受傷協(xié)迫條件下形態(tài)上的反應(yīng)。玻璃苗苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性低于正常植株。在協(xié)迫條件下乙烯的快速合成，又通過抑制氨基環(huán)丙烷羧酸（ACC）酶的形成，對(duì)乙烯起反饋調(diào)節(jié)作用。通過改善氣體交換防止玻璃化形成，可能與克服乙烯反饋抑制有關(guān)。一種與膜有關(guān)的過氧化物酶直接或間接摻入ACC合成乙烯�，F(xiàn)已證明，IAA-氧化酶體系至少在乙烯合成的最后一步起作用。IAA含量降低將進(jìn)一步通過IAA調(diào)節(jié)S-腺苷甲硫氨酸（SAM）轉(zhuǎn)化成ACC這一過程，從而降低了乙烯形成。Kevers等曾證明，對(duì)于玻璃苗，堿性過氧化酶同功酶活性增加，而酸性同功酶活性降低。但總可溶性過氧化物酶活性增加，僅限于堿性提取物。有人認(rèn)為，玻璃化的形成主要是膜的效應(yīng)而與核酸無關(guān)。乙烯促進(jìn)了葉綠素分解及細(xì)胞的畸形發(fā)展。乙烯處理破壞了膜的結(jié)構(gòu)，隨著細(xì)胞壁解離，細(xì)胞內(nèi)積累大量纖維素及泡狀物質(zhì)�？梢姡�乙烯對(duì)玻璃化的影響，與改變組織的生理生化及纖維結(jié)構(gòu)有關(guān)。

       Hakkart F. A. 等認(rèn)為玻璃苗是培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)氣體與外界交換不暢造成的。密閉的封瓶口材料是導(dǎo)致玻璃化的原因之一（陳國(guó)菊等1992，李云等1996）。

（五）培養(yǎng)材料

       有人發(fā)現(xiàn)不同部位的節(jié)段外植體與玻璃化有關(guān)，以留蘭香基部節(jié)段所形成的試管苗玻璃苗嚴(yán)重，中部莖段次之，莖尖最好（柴明良）；重瓣絲石竹中部莖段出現(xiàn)玻璃苗較多，基部莖段較少，莖尖沒有（郭達(dá)初）。郭東紅等（1989）認(rèn)為瑞香莖尖外植體大小與玻璃化相關(guān)，莖尖外植體越小，出現(xiàn)玻璃苗比率越大。

二、玻璃苗的生理生化特征

（一）玻璃苗中纖維素和木質(zhì)素含量的變化

       李云等（1996）利用放射性同位素技術(shù)研究了玻璃苗中纖維素和木質(zhì)素含量，發(fā)現(xiàn)在整株珠美海棠（Malus zumi）玻璃苗中纖維素和木質(zhì)素含量均低于正常苗、比正常苗減少43.68%。在玻璃苗的不同部位中其含量也表現(xiàn)出同樣的規(guī)律，即在玻璃苗的莖尖段和莖基段中纖維素和木質(zhì)素含量均低于正常苗，其含量是正常苗對(duì)應(yīng)部位的60.64%和50.94%，同樣在葉片和莖中纖維素和木質(zhì)素含量也均低于正常苗，是正常苗對(duì)應(yīng)部位的74.19%和47.69%。經(jīng)研究證明，造成玻璃苗中纖維素和木質(zhì)素含量低的原因是試管苗發(fā)生玻璃化過程中，其體內(nèi)纖維素和木質(zhì)素合成下降，分解增加，尤其以莖尖段和葉片表現(xiàn)最嚴(yán)重，造成植物體內(nèi)纖維素和木質(zhì)素嚴(yán)重缺乏，從而表現(xiàn)為莖、葉呈水浸狀、卷曲，生長(zhǎng)不良等玻璃化現(xiàn)象。

（二）玻璃苗中礦質(zhì)元素含量的變化

       李云等（1996）通過中子活化技術(shù)分析了珠美海棠玻璃苗中的元素含量，發(fā)現(xiàn)多數(shù)元素在玻璃苗中的含量均低于正常苗，如Cl、Na、Mo、Sb、Mn、I、K、Fe、As、Zn、Ca、Mg、Co、Al、Br共16種，它們是正常苗相應(yīng)元素含量的31%-92%，其中Al、Na、Mo、Sb含量較正常苗中的低得多，占正常苗中相應(yīng)元素含量的31%、51%、56%、58%。在玻璃苗中Al、As、Br、Sb元素含量低于正常苗。提高培養(yǎng)基中瓊脂或蔗糖含量相應(yīng)地增加了上述元素和必需元素的含量，滿足了植物的正常代謝對(duì)元素的需要，從而降低了玻璃苗的發(fā)生。如增加Difco Bacto瓊脂濃度，培養(yǎng)基中Ca、Cu、Mg、Mn、K、Na離子含量提高，徐妙珍認(rèn)為增加瓊脂含量，相對(duì)提高了培養(yǎng)基Ca、Mg、Fe、K等元素含量，從而抑制了玻璃苗的發(fā)生。戴桂林等認(rèn)為，不同品牌的瓊脂中元素含量不一致，因此，選擇不同品牌的瓊脂均會(huì)影響元素含量，對(duì)玻璃化的抑制有所不同。

       玻璃化發(fā)生時(shí)，首先是生長(zhǎng)旺盛的莖尖段元素含量下降，其次是葉片中元素含量的下降，再次是莖段。劉思穎等（1988）用X射線能量色散譜儀及元素的點(diǎn)掃描測(cè)得絲石竹玻璃苗葉片中P、Fe、Cu、Mn、Mo等元素含量比正常苗低，而Ca、K元素含量比正常苗高；玻璃苗中保衛(wèi)細(xì)胞中K元素含量比正常苗低，P、Al、Zn等元素含量則比正常苗高。王家旺等（1990）在油菜莖尖培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)MS培養(yǎng)基上的玻璃苗比例明顯低于B5培養(yǎng)基，提高B5培養(yǎng)基中NH4+、Ca、Zn和Mn含量時(shí)，玻璃苗比例降低，而提高B含量時(shí)，玻璃苗比例上升。

三、玻璃苗發(fā)生的機(jī)理

       Kevers等的試驗(yàn)表明，蘋果砧木M7等的玻璃苗是由于過氧化物酶——吲哚乙酸氧化酶系統(tǒng)控制的乙烯過飽和的影響，并認(rèn)為細(xì)胞激動(dòng)素和NH4+離子的過剩是一種最初的脅迫，受脅迫的試管苗在乙烯過剩的空氣中，抑制了乙烯的生物合成，結(jié)果降低苯丙氨酸解氨酶（PAL）和酸性過氧化物酶的活性，從而妨礙組織木質(zhì)化，導(dǎo)致形成玻璃苗。一種誘導(dǎo)協(xié)迫（過多的細(xì)胞分裂素和NH4+），可以通過酚含量的快速化調(diào)節(jié)不斷增加的過氧化物酶活性。乙烯的大量形成又對(duì)其自身起反饋抑制作用，結(jié)果PAL和酸性過氧化物酶活性降低，從而抑制木質(zhì)化過程的進(jìn)行。糖用于氨基酸的合成，纖維素含量降低。由于缺乏纖維素和木質(zhì)素，壁壓降低，從而細(xì)胞過分吸水，并導(dǎo)致玻璃化。

       張洪勝等認(rèn)為在試管苗玻璃化過程中，作為內(nèi)源激素的乙烯從代謝調(diào)節(jié)上起了關(guān)鍵性啟動(dòng)作用。而乙烯的產(chǎn)生則取決于培養(yǎng)環(huán)境中的脅迫條件，如水勢(shì)不當(dāng)，通氣不暢（造成缺氧）及培養(yǎng)基用BA量過高等，均會(huì)導(dǎo)致乙烯產(chǎn)生。乙烯產(chǎn)生后引發(fā)了其他激素質(zhì)和量上的改變及酶類的變化。因此，發(fā)生蛋白質(zhì)、纖維素和木質(zhì)素的合成障礙及降解，葉綠素分解黃化，逐漸形成玻璃化癥狀；張昆瑜等（1991）認(rèn)為乙烯克服試管苗玻璃化的機(jī)理是復(fù)雜的，在添加乙烯前體ACC（1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸）和乙烯釋放劑CEPA（乙烯利）的培養(yǎng)基上證明乙烯對(duì)香石竹試管苗干物質(zhì)積累及組織、器官的發(fā)育有利。并發(fā)現(xiàn)ACC可促進(jìn)煙草愈傷組織中的過氧化物酶和苯丙氨酸裂解酶的活性，加強(qiáng)磷酸戊糖途徑與抗氰交替途徑，前兩個(gè)酶是促進(jìn)木質(zhì)素合成和細(xì)胞壁形成的關(guān)鍵酶，磷酸戊糖途徑與葉綠素前體的合成有關(guān)，抗氰交替途徑則降低了ATP的合成，從而抑制了過度主動(dòng)吸水，提高了蛋白質(zhì)和干物質(zhì)的含量。

       李云等（1996）發(fā)現(xiàn)植物光呼吸途徑和磷酸戊糖（HMP）途徑均與玻璃苗的產(chǎn)生有關(guān)，即當(dāng)上述兩條呼吸途徑的一條或兩條同時(shí)受阻時(shí)，均增加玻璃苗。密封瓶口、高溫、高濃度細(xì)胞分裂素等因子加快了生長(zhǎng)速度，加劇了瓶中氣體組成的改變，對(duì)瓶?jī)?nèi)外氣體交換提出更高要求，當(dāng)這種要求不能滿足時(shí)便出現(xiàn)玻璃化。HMP途徑的中間步驟與戊糖化合物代謝有關(guān)（如核酸合成），也與木質(zhì)素形成有關(guān)。當(dāng)HMP途徑被抑制時(shí)，壁的再生受抑制，戊糖化合物減少，核酸、蛋白質(zhì)合成受阻。當(dāng)光呼吸途徑被抑制時(shí)，減弱了光呼吸對(duì)光合的保護(hù)作用，過剩的同化物損壞了光合細(xì)胞器，不僅降低了光合作用，同時(shí)也阻礙了乙醇酸的的轉(zhuǎn)化，加重了乙醇酸對(duì)植物的毒害作用，從而導(dǎo)致玻璃化的產(chǎn)生。

四、防止和克服玻璃苗的措施

       盡管關(guān)于玻璃化的成因及其生理機(jī)制到目前為止仍未得出一致的結(jié)論，但對(duì)某些植物的玻璃化已得到有效的控制。這些研究表明，控制玻璃化要從培養(yǎng)的環(huán)境條件和生理生化方面入手，可以通過降低培養(yǎng)基的水勢(shì)；減少培養(yǎng)基中含氮化合物的用量；增加光照強(qiáng)度；調(diào)整培養(yǎng)溫度；降低培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素的用量；提高培養(yǎng)基的硬度等，具體措施如下：

（1）適當(dāng)提高培養(yǎng)基中蔗糖含量或加入滲透劑，降低培養(yǎng)基中的滲透勢(shì)，減少培養(yǎng)基中植物材料可獲得的水分，造成水分脅迫�；蚪档团囵B(yǎng)瓶?jī)?nèi)部環(huán)境的相對(duì)濕度。而利用固體培養(yǎng)方式，增加瓊脂濃度，降低培養(yǎng)基的襯質(zhì)勢(shì)，造成細(xì)胞吸水阻遏，也可降低玻璃化，如將瓊脂濃度提高到1.1％時(shí)，洋薊的玻璃化苗完全消失。

（2）適當(dāng)降低培養(yǎng)基中的細(xì)胞分裂素和赤霉素的濃度�；蛘�，適當(dāng)增加培養(yǎng)基中Ca，Mg，Mn，K， P，F(xiàn)e，Cu，Zn元素含量，降低N和Cl元素比例，特別是降低銨態(tài)氮濃度提高硝態(tài)氮含量。

（3）增加自然光照。在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，玻璃苗放在自然光下幾天后莖、葉變紅，玻璃化逐漸消失。這是因?yàn)樽匀还庵械淖贤饩�能促進(jìn)試管苗成熟，加快木質(zhì)化�；蛘呖刂茰囟龋�熱擊或低溫處理），防止玻璃化，如用40℃熱擊處理瑞香愈傷組織培養(yǎng)物可完全消除其再生苗的玻璃化，同時(shí)還能提高愈傷組織的芽分化頻率（周菊花等）。

（4）降低培養(yǎng)容器內(nèi)部環(huán)境的相對(duì)濕度，改善培養(yǎng)器皿的氣體交換狀況，如使用棉塞或通氣好的封口膜封口。

（5）在培養(yǎng)基中添加其它物質(zhì)。在培養(yǎng)基中加入間苯三酚或根皮苷或其它添加物，可有效的減輕或防止試管苗玻璃化，如添加馬鈴薯汁可降低油菜的玻璃苗的產(chǎn)生頻率，而用0.5mg·L－1多效唑或10 mg·L－1的矮壯素可減少重瓣絲石竹試管苗玻璃化的發(fā)生；而添加1.5-2.0g·L－1的聚乙烯醇也成為防治蘋果砧木玻璃化的措施。在培養(yǎng)基中加入0.3％的活性炭還可降低玻璃苗的產(chǎn)生頻率，對(duì)防止玻璃化有良好作用。有研究還表明，（6）青霉素G鉀（2mg/L-6mg/L）能有效防治菊花試管苗的玻璃化（陳龍清等），青霉素（40萬單位/升）可降低芥菜試管苗的玻璃化（陳國(guó)菊等）。

（6）用40℃熱擊（周菊華等）處理瑞香愈傷組織培養(yǎng)物，可完全消除再生苗的玻璃化，且能夠提高愈傷組織的芽分化頻率，熱擊處理會(huì)降低內(nèi)源細(xì)胞分裂素水平。

     盡管如此，不同植物在不同條件下，也許會(huì)得出不同的結(jié)論或相反的結(jié)果。更有效的玻璃化控制途徑，有待于進(jìn)一步研究。

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